Aktywacja onkogenu K-ras jako marker prognostyczny w gruczolakoraku płuc ad

Dodatkowa sekcja 5 .m została wybarwiona hematoksyliną i eozyną i została użyta do klasyfikacji guza i do określenia proporcji komórek nowotworowych w próbce. Skrawki guza poddano deparafinizacji ksylenem, a następnie etanolem i wysuszono w eksykatorze próżniowym. Po dodaniu sterylnej wody, DNA w próbce poddano denaturacji cieplnej i użyto do amplifikacji in vitro.5 Ponadto analizowano DNA wyizolowane z 1025 .m skrawków guza zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji DNA6. Łańcuch polimerazy. – Przeprowadzono cykle reakcji w 92 ° C w celu denaturacji DNA, w temperaturze 55 ° C w celu hybrydyzacji starterów, iw temperaturze 70 ° C w celu syntezy DNA, przez 1,5 minuty w każdej temperaturze, w urządzeniu Dri-block (Techne, Cambridge, USA). Wielka Brytania), z użyciem polimerazy Taq (Perkin-Elmer-Cetus, Emeryville, CA) w buforze zgodnie z zaleceniami producenta. Około 100 ng DNA wyizolowanego z 25-.m skrawków amplifikowano przez 30 do 35 cykli, a DNA w pojedynczych 5-.m skrawkach amplifikowano przez dodatkowe 30 cykli. Z każdej reakcji około 10 ng zamplifikowanych fragmentów DNA nakropiono na membrany nylonowe (Hybond, Amersham, Wielka Brytania) w celu analizy hybrydyzacji. Mutacje punktowe wykryto przez hybrydyzację ze znakowanymi 32P oligonukleotydami specyficznymi dla różnych sekwencji ras. Sekwencje oligonukleotydowe, warunki hybrydyzacji i skład 31 użytych sond zostały opisane wcześniej.3 DNA wyodrębnione z zamrożonych próbek nowotworu przeszukiwano pod kątem aktywacji mutacji punktowych w kodonach 12, 13 i 61 wszystkich trzech genów ras, podczas gdy parafina -błonowe próbki badano przesiewowo tylko pod kątem mutacji w kodonie 12 K-ras. Wszystkie próbki zawierały co najmniej 20 procent komórek nowotworowych.
Analiza danych klinicznych
Dla każdego pacjenta odnotowano następujące dane z dokumentacji medycznej po stwierdzeniu obecności lub braku mutacji genu K-ras w próbkach guza: wiek, płeć, historia palenia, obecność wcześniejszych lub równoczesnych guzów, patologia ocena marginesów resekcji, stadium i stopień zróżnicowania guza, lokalizacja nawrotu w razie potrzeby, czas przeżycia wolnego od choroby, czas przeżycia i przyczyna zgonu.
Analiza statystyczna
Krzywe przeżycia skonstruowano metodą Kaplana-Meiera. Porównania dokonano za pomocą testu log-rank i modelu proporcjonalnych hazardów Coxa. Wszystkie wartości P opierają się na dwustronnej analizie statystycznej; przyjęto, że wartość P mniejsza niż 0,05 wskazuje na istotność statystyczną.
Wyniki
Wykrywanie mutacji punktowych w K-ras Oncogenes
Zastosowano dwie strategie w celu określenia mutacji punktowych w K-ras: amplifikacji oczyszczonego DNA z zamrożonej lub zatopionej w parafinie tkanki i bezpośredniej amplifikacji DNA obecnego w pojedynczej 5-.m części tkanki. Analizowano 35 zamrożonych próbek, a 34 inne próbki uzyskano z utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie tkanek. Spośród 34 utrwalonych próbek, 29 zbadano zarówno przez izolację DNA, jak i bezpośrednią amplifikację odcinków tkanek; wyniki były identyczne. Dziewiętnaście z 69 guzów było pozytywnych pod względem mutacji punktowej w kodonie 12 onkogenu K-ras
[patrz też: zwapnienie aorty, rytuksymab, rak nerkowokomórkowy ]