Wirusowe DNA ospy wietrznej w ospę wietrzną w ludzkich zębodołach trójdzielnych i klatki piersiowej ad

DNA ekstrahowano trzy razy fenolem, dwa razy fenolem: chloroformem (1: 1) i trzy razy chloroformem, a następnie wytrącono etanolem; ekstrahowany DNA ponownie rozpuszczono w 0,010 M kwasie TRIS-kwas chlorowodorowy (pH 8,0) i 0,001 M buforze EDTA (bufor TE) (100 ul na 0,5 cm3 tkanki). Stężenie DNA oszacowano rejestrując gęstość optyczną przy 260 nm i końcowe stężenie DNA dostosowano do .g na mikrolitr. DNA ekstrahowano również z ludzkich jednojądrzastych komórek, jak opisano wcześniej Komórki, wirusy i przeciwciała
Propagacja wirusa ospy wietrznej-półpaśca i wirusa opryszczki pospolitej typu w komórkach afrykańskiej małpy zielonej (BSC-1) i ekstrakcji DNA została opisana w innym miejscu.10, 11 Obecność przeciwciała przeciwko wirusowi ospy wietrznej-półpaśca w ludzkiej surowicy oznaczane metodą immunoprecypitacji.12
Reakcja łańcuchowa polimerazy
Rysunek 1. Rysunek 1. Lokalizacja regionów w obrębie genomu wirusów ospy wietrznej i półkrwi użytego do detekcji z reakcją łańcuchową polimerazy. Wirusowy wirus ospy wietrznej-półpaśnej składa się z dwóch kowalencyjnie połączonych segmentów: unikalnego długiego (UL) segmentu i unikalnego krótkiego (US) odcinka ograniczonego przez odwrócone sekwencje powtórzeń (IRL / TRL i IRS / TRS). Oczekuje się, że gen wirusa ospy wietrznej-półpaśca 29, zlokalizowany w UL, koduje główne białko wiążące DNA.15 Początek replikacji wirusa ospy wietrznej-półpaśca (ORI) występuje w dwóch kopiach zlokalizowanych w IRS i TRS.16 Strzałki ponumerowane i 2 i oznaczone jako aib wskazują lokalizację i kierunek starterów oligonukleotydowych (24-merów) stosowanych do powielania regionów odpowiednio z genu 29 wirusa ospy wietrznej-półpaśca i miejsca początku replikacji; strzałki pod numerem 3 i litera c wskazują położenie i kierunek wewnętrznych starterów oligonukleotydowych wykorzystywanych do wykrywania odpowiednio amplifikowanych produktów z genu wirusa ospy wietrznej-półpaśca i miejsca początku replikacji.
Startery oligonukleotydowe wybrano z opublikowanych sekwencji wirusa ospy wietrznej-półpaśca i DNA globiny13, 14 i uzyskanych z Research Genetics (Huntsville, Ala.). Starter inicjujący start replikacji a (5 -GTGGGGGGGTGAAAAAGGGGGGGG-3 ) znajduje się pomiędzy nukleotydami 110,033 i 110 057 na genomie wirusa ospy wietrznej-półpaśca, starter b startu inicjacji b (5 -TCACGTCAAATCGATTTTAAAAAG-3 ) znajduje się pomiędzy nukleotydy 110,336 i 110,360 oraz wewnętrzny oligonukleotyd początku c miejsca pochodzenia replikacji c (5 -ATGTCTGTGGTGTACGCCAATCGG-3 ) znajduje się pomiędzy nukleotydami 110,076 i 110 100. Gene 29 koduje główne białko wiążące DNA. Starter genu-1 (5 -TACGGGTCTTGCCGGAGCTGGTAT-3 ) znajduje się pomiędzy nukleotydami 50.839 i 51.089, starter 2 genu-29 (5 -AATGCCGTGACCACCAAGTATAAT-3 ) znajduje się pomiędzy nukleotydami 51 314 i 51 338, a wewnętrznym oligonukleotydem genu 29 3 (5 -ACTCACTACCAGTACTTTCT-3 ) znajduje się pomiędzy nukleotydami 51 098 i 51 111 (fig. 1). Roztwory podstawowe zawierające .g oligonukleotydu na mikrolitr jałowej wody rozcieńczono w celu wytworzenia 20 .M podwielokrotności do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy.
Reakcja łańcuchowa polimerazy została przeprowadzona za pomocą dostępnego w handlu zestawu (Gene Amp Kit, Perkin-Elmer-Cetus, Emeryville, CA).
[więcej w: olx luboń, zapalenie przewodu słuchowego, cykliczna neutropenia ]