Wirusowe DNA ospy wietrznej w ospę wietrzną w ludzkich zębodołach trójdzielnych i klatki piersiowej cd

W typowej reakcji .g DNA tkankowego lub ng niezakażonego lub zakażonego wirusem DNA komórki lub równoważna objętość jałowej wody zastosowano jako matrycę w końcowej 100 .l mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0,010 M kwas solny-TRIS-chlorowodorowy (pH 8.3), 0,050 M chlorku potasu, 0,015 M chlorku magnezu i 0,01% żelatyny i trifosforanu deoksyadenozyny, trifosforanu deoksytymidyny, trifosforanu deoksycytydyny i trifosforanu deoksyguanozyny (każdy nukleotyd w końcowym stężeniu 200 .M), .mol każdego startera i 2,5 jednostki polimerazy DNA Thermus aqualicus (Taq). Próbki ogrzewano do 95 ° C przez pięć minut przed dodaniem polimerazy DNA Taq. Zautomatyzowany termocykler termiczny DNA (Perkin-Elmer-Cetus) został ustawiony na etap denaturacji przez 2 minuty w 94 ° C, etap wyżarzania 2 minuty w 45 ° C i etap wydłużania 3 minut w 72 ° C, który był automatycznie wydłużany o 15 sekund na cykl. Całkowita liczba cykli wynosiła 50. W doświadczeniach, które obejmowały startery beta-globiny, warunki były tymi opisanymi powyżej, z wyjątkiem tego, że etap denaturacji ustalono na jedną minutę w 95 ° C, etap wyżarzania ustawiono na dwie minuty w 60 ° C , a liczba cykli wynosiła 35.
Specyficzne dla wirusa sekwencje w produktach amplifikowanych
Syntetyczne oligonukleotydy reprezentujące region wewnętrzny amplifikowanego fragmentu rozpuszczono w sterylnej wodzie do końcowego stężenia 0,1 .g na mikrolitr, a próbkę (20 .l) użyto do końcowego znakowania adenozynowym trifosforanem [gamma-32P] (ICN, Costa Mesa). Kalif. 7000 Ci na milimol), jak opisano wcześniej
Swoistość amplifikowanej sekwencji określono metodą hybrydyzacji typu Southerna. Do analizy użyto jeden mikrolitr całkowitej objętości 100 .l mieszaniny polimerazy-łańcuch-reakcja zawierającej DNA komórek zakażonych wirusem ospy wietrznej i 12 .l z innych mieszanin. Amplifikowane fragmenty DNA rozdzielano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym w roztworze 0,04 M kwasu TRIS-octowego i 0,002 M buforu EDTA (pH 8,0). Fragmenty DNA w żelu agarozowym przeniesiono na membranę sondy Zeta (Bio-Rad, Richmond, CA), hybrydyzowano z sondami oligonukleotydowymi znakowanymi 32Pend i zidentyfikowano przez autoradiografię wykonywaną zgodnie z instrukcjami producenta. Rozmiar powielonego produktu określono przez porównanie go ze standardowymi markerami masy cząsteczkowej (drabina o długości 123 bp [base pair], z Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.).
Wyniki
Figura 2. Figura 2. Wykrywanie wirusowego DNA wirusa ospy wietrznej w grzybni ludzkiej za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy. Całkowity DNA ekstrahowano z niezakażonych komórek BSC-1 (BSC-1), dwóch zwojów nerwu trójdzielnego od dwóch dorosłych (dorośli A i B), ludzkiej tkanki mózgowej, ludzkiej wątroby, dwóch połączonych zwojów nerwu trójdzielnego i czterech połączonych zwojów piersiowych od niemowlęcia, który zmarł dwie godziny po urodzeniu, komórki jednojądrzaste człowieka od osoby seropozytywnej dla wirusa ospy wietrznej-półpaśca, komórek BSC-1 zakażonych wirusem herpes simpleks (HSV) i komórek BSC-1 zainfekowanych wirusem ospy wietrznej-półpaśca (VZV). Jako eksperyment kontrolny, DNA zostało pominięte w jednej z probówek reakcyjnych (brak DNA). Jedna nanogram DNA z niezakażonych i zakażonych wirusem ospy wietrznej oraz .g DNA z innych próbek użyto do amplifikacji regionu początku replikacji wirusa ospy wietrznej i półpaśca.
startery oligonukleotydowe reprezentujące miejsce inicjacji replikacji wirusa ospy wietrznej-półpaśca i gen 29 wybrano z opublikowanej sekwencji nukleotydowej genomu wirusa13 (ryc.
[patrz też: olx luboń, zwapnienie aorty brzusznej, witamina c lewoskrętna gdzie kupić ]